联合基因（CD和TNF-α）治疗喉癌的实验研究

张小盒 · 发表于 2014-12-10 10:55

研究目的:
通过构建自杀基因CD联合细胞因子TNF-α基因共表达的非病毒载体并导入喉癌Hep-2细胞，观察CD基因和TNF-α基因共表达产物在5-FC作用下于体内外对喉癌细胞系Hep-2的杀伤作用及机理。
研究方法:
1.分别构建目的基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/TNF-α-IRES-CD、pcDNA3.1(+)/CD、pcDNA3.1(+)/TNF-α，并用限制性内切酶、PCR和DNA测序进行鉴定。
2.将以上各基因真核表达载体及pcDNA3.1(+)空白质粒在Lipofectamine　2000介导下分别转染喉癌细胞Hep-2,G418筛选出抗性克隆并扩大培养，建立稳定表达株，分别命名为Hep-2/TIC（TNF-α- CD）、Hep-2/CD、Hep-2/ TNF-α、Hep-2/０，RT-PCR检测各目的基因的表达。
3. MTT法检测0.001、0.01、0.1、1、10mmol/L不同浓度的5-FC分别对Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/ TNF-α、Hep-2/０各组细胞的体外杀伤作用。
4. MTT法检测在1mmol/L 5-FC作用下，Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/ TNF-α、Hep-2/０各组细胞与不同比例的亲代细胞混合时产生的旁观者效应（各组细胞占混合细胞的比例分别为10%、20%、50%）。
5. 流式细胞仪检测在1mmol/L 5-FC作用下，Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/ TNF-α、Hep-2/０各组细胞凋亡率。
6. 在BALB/c裸鼠构建Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/ TNF-α、Hep-2/０四组人喉鳞癌皮下移植瘤裸鼠模型。细胞接种的第8天（移植瘤直径约5mm）开始，每天腹腔给予5-FC或相同剂量NS，连续12天。比较给药前后肿瘤体积变化、肿瘤倍增时间及抑瘤率，通过病理切片观察组织病理变化。
7. 统计学方法：采用SPSS12.0统计软件。数据以均数±标准差（ ±s）表示，用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果:
1.真核表达载体pcDNA3.1(+)/CD、pcDNA3.1(+)/TNF-α、pcDNA 3.1(+)-TNF-α-IRES-CD构建成功，经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序证实各插入基因及联合基因的大小、位置、方向均正确无误。
2. RT-PCR证明各重组外源基因在人已转染目的基因的喉癌细胞系Hep-2中均有表达。
3. MTT检测不同浓度5-FC对Hep-2/TIC，Hep-2/CD组细胞有杀伤作用，并随5-FC浓度增加，细胞杀伤作用增强。其中相同浓度的5-FC对Hep-2/TIC组的杀伤作用大于Hep-2/CD组，两组存活率比较差异有显著性（P<0.05）。相同浓度5-FC作用下，Hep-2/TNF-a组细胞存活率低于Hep-2/CD组（P<0.05）及Hep-2/TIC组（P<0.05），高于Hep-2/０组（P<0.05）。在低于1mmol/L 5-FC作用下，Hep-2/０组细胞生长基本不受影响。在10mmol/L 5-FC作用下，Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/ TNF-α、Hep-2/０四组细胞存活率分别为（2.54±1.57）%、（4.07±2.60）%、（67.33±4.46）%、（77.88±1.82）%；在10mmol/L 5-FC作用下，Hep-2/TIC与Hep-2/CD组细胞存活率均小于5%，此两组之间比较差异无显著性（P>0.05）；10mmol/L 5-FC对Hep-2/TNF-a组和Hep-2/０组细胞也有不同程度的非特异杀伤作用，两组细胞各自相对于自身在无5-FC （0mmol/L）作用时的存活率差异均有显著性（P<0.05）。
4. 在1mmol/L 5-FC作用下，CD基因在体外即显示出明显的杀伤作用（含旁观者效应），20%的转CD基因细胞可以杀死70%-80%的肿瘤细胞，随着CD基因表达阳性细胞Hep-2/TIC,Hep-2/CD比例的增加，混合细胞存活率逐渐下降；且在相同混合比例时，Hep-2/TIC组的细胞杀伤作用均大于Hep-2/CD组（P>0.05）；Hep-2/TNF-a组和Hep-2/０组细胞没有表现出旁观者效应。
5. 流式细胞仪检测在1mmol/L 5-FC作用下，Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/ TNF-α、Hep-2/０四组细胞凋亡率分别为（2.73±0.42）%、(28.53±1.25) % 、(38.13±2.32)% 、 (53.93±2.22)%，四组细胞凋亡率两两之间比较差异均有显著性（P<0.05），其中Hep-2/TIC组的细胞凋亡率最高。
6. 经典的喉鳞癌皮下种植方法成功构建人喉鳞癌裸鼠模型，细胞注射数量
为5×106，成瘤率83%，成瘤时间6-8天。
7. Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/ TNF-α、Hep-2/０四组裸鼠移植瘤的倍增时间分别为5.34天，4.01天，2.99天，2.91天，Hep-2/TIC组裸鼠移植瘤体积倍增时间延长。
8. 5-FC治疗前，Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/ TNF-α、Hep-2/０四组裸鼠移植瘤体积大小比较两两之间差异无显著性(P>0.05)。5-FC治疗第12天，Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/ TNF-α、Hep-2/０四组裸鼠移植瘤体积比较两两之间差异有显著性(P<0.05)，Hep-2/TIC组裸鼠移植瘤平均体积最小。
9. 5-FC治疗第12天，Hep-2/TIC、Hep-2/CD、Hep-2/ TNF-α三组裸鼠移植瘤相对于Hep-2/０组的抑瘤率分别97.40%、88.58%、24.96%。CD与TNF-a基因联合治疗（Hep-2/TIC组）的抑瘤效果得到明显增强，抑瘤率达97.40%，优于CD（Hep-2/CD组）或TNF-a基因（Hep-2/ TNF-α组）单独治疗的效果，在Hep-2/TIC组，有一只鼠的移植瘤在5-FC治疗后完全消除。
10. 裸鼠移植瘤病理切片HE染色见CD与TNF-α基因联合治疗（Hep-2/TIC组）后肿瘤细胞内有大量淋巴细胞浸润。Hep-2/CD组结合5-FC治疗后，肿瘤内有较多坏死组织及有少量淋巴细胞浸润。Hep-2/TNF-α组肿瘤内见大量坏死组织。Hep-2/０组可见低分化鳞状细胞肿瘤组织，有许多有丝分裂相的肿瘤细胞和瘤巨细胞，肿瘤坏死及淋巴细胞浸润不明显
结论:
1. 成功构建了pcDNA3.1(+)/CD、pcDNA3.1(+)/TNF-α、pcDNA3.1(+)-TNF-α-IRES-CD真核表载体，并通过G418筛选出稳定转染的喉癌Hep-2细胞株。
2. 在体外实验中，CD与TNF-α联合基因共表达产物在5-FC作用下，于杀伤喉癌Hep-2细胞中具有协同作用，不仅转CD基因细胞被杀死，而且通过旁观者效应杀伤大量周围未转CD基因的肿瘤细胞。
3. 在体内实验中，CD与TNF-α联合基因共表达产物在5-FC作用下，对人喉鳞癌裸鼠皮下移植瘤有显著杀伤作用。这可能为喉鳞癌的基因治疗提供一条新的途径。