喉鳞状细胞癌中CDKN1C基因杂合性缺失和印记缺失的实验研究

张小盒 · 发表于 2014-12-9 16:38

[目的]为了探讨喉癌中CDKN1C基因的杂合性和印记状态，在基因内部和下游各选取一个微卫星位点TH01和D11S2359，在基因内部选取一个酶切位点rs3852522，采用PCR、RT-PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染及酶切等方法对选定位点进行检测，以揭示其中的分子生物学机制及内在联系，在基因水平上为LSCC的早期诊断提供新的思路，早期发现高危人群，早期干预。
[材料和方法]实验材料：40例喉癌标本取自中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科2007年5～12月间手术切除病例。实验方法：抽提基因组DNA，PCR扩增TH01和D11S2359片段，产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，拍照，判断结果，筛选出杂合子。抽提杂合子组织RNA，反转录反应合成cDNA，扩增酶切位点片断，检验扩增产物。使用FspBI酶对杂合子cDNA扩增产物进行酶切，产物进行琼脂糖凝胶电泳。采用SPSS12.0统计软件进行分析。采用χ2检验，Fisher确切概率法( Fisher Exact Test) ,检验水准为双侧P<0.05差异有显著性意义。
[结果]1.CDKN1C基因TH01和D11S2359位点LOH情况：在CDKN1C基因上选取2个微卫星位点，即TH01和D11S2359进行杂合性检测。结果在40例喉癌组织中共有18例（45%）至少在一个微卫星位点上检测到LOH，而在正常对照组中，仅在D11S2359位点上检测到1例存在LOH，占9.1%（1/11），与喉癌组织中存在显著性差异（P<0.05）。在Ⅱ期，Ⅲ期，Ⅳ期喉癌之间存在显著性差异（p<0.05）。在声门上型，声门型，声门下型喉癌之间没有统计学差异（p>0.05）。2.CDKN1C基因的印记状态:22例杂合子肿瘤标本中有13例CDKN1C双等位基因表达(59.1% ) 。非病变组织10例杂合子中有2例为双等位基因表达(20.0% ) 。喉癌组织的CDKN1C基因通过双等位基因表达印记缺失，但喉癌组织的CDKN1C印记状态与正常组织无显著性差异( P = 0.060>0.05)。
[结论]1、在LSCC的发生发展中，CDKN1C基因TH01和D11S2359位点出现频繁的LOH，可能是其功能失调的重要原因之一。2、LSCC中存在一定比例的CDKN1C基因印记缺失，但该基因印记状态与肿瘤的关系和正常组织相比并没有显著差异。3、CDKN1C基因发生状态改变的原因除LOH外，应该还存在其它机制。