耳蜗内电刺激对听觉剥夺幼鼠听皮层NMDA受体亚单位mRNA及蛋白的影响

张小盒 · 发表于 2014-12-4 19:17

摘要：
目的：检测不同发育阶段耳蜗内电刺激对听觉剥夺幼鼠听皮层NMDA受体表达水平的影响。
方法：选用健康SD幼鼠随机分组：（1）听觉剥夺组（auditory deprivation ,AD），依年龄分3周龄组（P3w ，n=15）、4周龄组（P4w ，n=15）、5周龄组（P5w ，n=15）、7周龄组（n=15，P7w ）、8周龄组（n=15，P8w ）；（2）早期耳蜗内电刺激组（early intracochlear electrical stimulation ，ICES1，n=15)；（3）晚期耳蜗内电刺激组(late intracochlear electrical stimulation， ICES2，n=15)；（4）对照组(normal control, NC)。依年龄分4周龄组（P4w ）、8周龄组（P8w ），每组各15只。听觉剥夺组：在生后第7天开始用阿米卡星（Amikacin）500mg/kg.d皮下注射，直到生后第16天。对照组：生后第7天开始每日皮下注射相同次数、同等容量的生理盐水，直至生后第16天。耳蜗内电刺激组：对听觉剥夺的幼鼠分别于生后3周龄（早期干预组，ICES1）和生后7周龄（晚期干预组，ICES2）用戊巴比妥30mg/kg,腹腔注射麻醉后，在手术显微镜下打开听泡的外侧壁，暴露圆窗。两根直径为0.42mm、电极间距离为0.45mm的充满硅胶的铂合金电极环分别与单根直径为0.1mm铂合金电线相连，电极环轻柔地插入鼓阶的基底部2-3mm电极的顶部不绝缘，其它部分用硅胶包裹绝缘。电线用超能胶固定在颅骨顶部。参考电极插入听泡附近的颞肌内。自制方波刺激器和匹配的PC卡能调节频率30HZ、脉宽50us、电流强度0.6-1.5mA,进行实验刺激。刺激参数的变动范围是：频率为30-2000HZ，脉宽25-100 us，电流强度50-4000 μA，均为双相脉冲。使电诱发的最大脑干反应振幅范围在0.71~1.9μν(波III)与50~90dB nHL声刺激诱导的振幅对应。电刺激持续3小时/天，共1周。Western Blot 方法测定耳蜗电刺激后听皮层组织NR1、NR2A、NR2B蛋白表达，并用RT-PCR方法测定NR1、NR2A、NR2B mRNA的表达水平。
结果：NR1、NR2A 、NR2B蛋白在各组幼鼠听皮层表达水平分别以NR1/GAPDH、NR2A/ GAPDH、NR2B/ GAPDH 表示。结果显示：ICES 1组NR1、NR2A及NR2B蛋白表达明显高于同龄的AD组（P均<0.05），达到或超过同龄NC组NMDA各亚单位表达水平。ICES2组 NR1蛋白表达仍过度表达，明显高于AD组与NC组（P均<0.05），NR2A 、NR2B与AD组表达水平基本一致（P>0.05）。各组样品NR1、NR2A与NR2B mRNA的表达水平分别以NR1/β-actin、NR2A/β-actin和NR2B/β-actin 表示，结果显示：与AD组比较，ICES 1组NR1mRNA、 NR2AmRNA及NR2B mRNA 表达水平均明显增高（P<0.05）； ICES 2组NR1mRNA表达水平仍显著高于同龄AD组（P<0.05）， NR2AmRNA及NR2B mRNA分别与同龄AD组比较，表达水平无明显统计学差异（P>0.05）。
结论：早期耳蜗内电刺激可显著提高NMDA受体亚单位蛋白及转录水平，这与学习记忆成绩变化一致，提示早期耳蜗内电刺激具有改善听觉剥夺后认知功能障碍的作用。
关键词：听觉剥夺；NMDA受体；耳蜗内电刺激；听皮层