Ad5-atoh1-egfp在体诱导豚鼠耳蜗产生新生毛细胞的实验观察

张小盒 · 发表于 2014-12-2 19:46

【摘要】
目的：在体在豚鼠耳蜗内利用携带atoh1/egfp基因的腺病毒诱导基底膜上的支持细胞转分化为新的毛细胞。
方法：选用体重在200-250g之间的健康，毛色光亮，无耳疾的青年花豚鼠24只，分为试验组（12只）和对照组（12只），将构建的同时表达atoh1和egfp基因的E1/E3区缺失的人类免疫5型腺病毒（Ad-atoh1/egfp）5ul，通过耳蜗侧壁打孔灌注导入试验组动物的中阶内淋巴系统。对照组采用同样方法灌注Ad-egfp5ul。每组分别有6只于灌注2周后处死，6只灌注4周后处死，4%多聚甲醛固定，基底膜铺片和冰冻切片，免疫组化，观察egfp、毛细胞标记物myosinVIIa和Dapi核染色情况。
结果：试验组中灌注2周处死的6只豚鼠中有2只在基底膜原外毛细胞下方的支持细胞区域、外毛细胞外支持细胞区域，发现有散在的核大、胞体梭形的、表达egfp的新生细胞。灌注4周的动物中有3只在基底膜原外毛细胞位置和外毛细胞外区域发现有相似的同时表达egfp和MyosinVIIa的新生细胞。而对照组尽管在8只动物中发现了内淋巴系统内有egfp的表达，但是没有发现同时表达MyosinVIIa的毛细胞存在。
讨论：由于使用了EGFP 指示蛋白，我们可以确定表达EGFP的细胞是被腺病毒转染的那么同时表达atoh1基因是明确的。而MyosinVIIa 同时在EGFP的细胞中表达说明该细胞内表达了atoh1基因，同时又是毛细胞。本研究发现了这样的毛细胞在非毛细胞位置出现的现象，并且这种灌注方法可以有效的去除灌注点上下圈基底膜上的外毛细胞，因此在外毛细胞位置出现的这类细胞也不是原来的毛细胞。而仅转染EGFP基因的对照组没有发现同时表达EGFP和MyosinVIIa的毛细胞，因此本实验证实了atoh1基因可以将支持细胞转分化为新生毛细胞。