IL-10基因重组慢病毒载体不同途径导入内耳局部治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究

张小盒 · 发表于 2014-12-2 19:44

摘要
目的：探讨携带GFP的重组复制缺陷型慢病毒为载体的白介素IL-10基因对实验性自身免疫性感音神经性耳聋的治疗作用，同时了解内耳和中耳局部注射后慢病毒载体在内耳组织结构中的转染情况和治疗基因局部表达情况。并通过三种不同注入方式的比较，探讨一种高效、安全和简便的内耳疾病基因导人方法。方法：采用纯化豚鼠内耳组织抗原58kD，免疫豚鼠，造成自身免疫性感音神经性聋的动物模型60只，按配对设计，将动物分为六组：A、B、C组为实验组，注射重组治疗基因载体。A组鼓阶内注射，B组中耳腔注射（浸有携带目的基因的重组慢病毒载体明胶海绵贴放在圆窗龛局部），C组内淋巴囊局部注射。D、E、F为对照组，为模拟手术对照组。注入生理性外淋巴液。D组鼓阶内注射，E组中耳腔注射（浸有携带目的基因的重组慢病毒载体明胶海绵贴放在圆窗龛局部），F组内淋巴囊局部注射。内耳抗原免疫前后和基因治疗后（7天），采用ELISA试验测试血清特异性抗体水平。治疗前和治疗后（7天）行听性脑干诱发电位（ABR）测试，并取内耳行光镜和电镜观察。每组各取4只行免疫荧光和酶免疫组织化学试验，以检测基因产物表达和慢病毒转染情况。结果：各实验组血清特异性抗体水平（A值的均值）比较：免疫后均较免疫前升高，差异有显著性；治疗前后则无显著性差异。治疗前后ABRⅢ波阈值的均值对比，显示各实验组:与免疫前相比，免疫后各组ABR平均阈值升高，差异均有显著性。与内耳抗原免疫后相比，实验A组、B组和C组基因治疗后ABR平均阈值降低，差异亦均有显著性。对照组：注入生理性外淋巴液后ABR平均阈值无明显变化，差异无显著性。荧光显微镜观察，实验耳显示载体荧光主要显示部位：A组：血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围；B组：螺旋神经节、螺旋韧带、Corti器、血管纹，蜗轴小血管周围前庭膜等处都有荧光表达；C组：内淋巴囊、内淋巴管、前庭囊斑、壶腹嵴等处。酶免疫组织化学观察结果显示各组实验耳基因产物表达部位：A组：血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围；B组：螺旋神经节、螺旋韧带、Corti器、血管纹，蜗轴小血管周围前庭膜等处；C组：内淋巴囊、内淋巴管、前庭囊斑、壶腹嵴等处。结论：采用纯化豚鼠内耳组织58kD抗原免疫豚鼠，可成功造成自身免疫性感音神经性聋的动物模型。采用携带目的基因的重组复制缺陷型慢病毒载体经不同途径（包括中耳腔注射、鼓阶内注射和内淋巴囊局部注射）均转导入内耳，并在内耳表达基因产物（IL-10）。听觉功能测试和内耳病理形态学观察结果显示：三种途径均可有效改善豚鼠的听力，手术本身并未明显影响听力。鼓阶和圆窗途径转染部位相似。圆窗途径组织损伤轻,能保持耳蜗的自然解剖结构。内淋巴囊接种载体到达范围广, 可有效的转染经鼓阶不易达到的部位,该途径可能具有较特殊的应用价值。中耳腔圆窗途径操作简单易行，作者认为其有较好的应用前景。