骨缺损修复生物工程研究进展

程觉 · 发表于 2014-11-19 11:11

骨缺损在临床上发病率较高，其治疗是骨科重要的技术问题。骨缺损治疗虽然可采用骨移植、组织工程技术、膜引导性组织再生技术、基因疗法等，但没有彻底的进行骨缺损修复的方法，为了对临床工作有启发和借鉴，本文将近些年应用的一些生物工程新技术进行综述。

骨移植对骨缺损的修复

移植骨来源分为自体骨、异体骨和人工骨，自体骨最常用，人工骨最少用。近年来研究表明骨移植在某些方面亚于生物材料而多用于不负重缺损部位。

自体骨移植要选择骨源充足，符合缺损部位骨强度，血管供应丰富以及骨诱导能力强的移植骨。其移植优势在于能尽早填补骨缺损，没有免疫反应。骨源主要是松质骨和带血管腓骨，一般不选用单纯皮质骨，虽其早期有良好支撑作用，但几乎没有骨诱导能力。而自体带血管骨移植是骨折愈合的一个里程碑，它使爬行替代的传统愈合方式转向一般骨折愈合，如带血管的腓骨移植应用相对较多，腓骨血管口径粗术中方便吻合。但有可能引起供骨部位的不同程度损伤，如线性结构的不完整造成的骨折。

松质骨移植多取自身骨盆骨，如髂骨，安全，费用不高，有利于移植后营养物质的渗透播散和微血管的吻合，但是其在血管，新骨生成、后期生活质量(如髋骨移植造成的移植部位神经损伤和长期的疼痛)以及美观上尚有不足。目前关于何时进行自体骨移植还没有具体定论，但是有学者认为应该尽早进行。异体骨移植可解决骨源问题，尤其在有骨库的欧洲，异体骨多被制备为新鲜冷冻骨及冻干骨保存以备不时之需。

同时异体骨可提供骨传导支架填补骨缺损并保留大部分骨诱导蛋白成分，却带来了较强的免疫反应(高分化的异体骨细胞，缺乏基质成分，组织相容性较弱)，其中以骨髓的免疫反应最强(在一定程度上会削弱骨诱导和骨生成)，需要术前术后长期使用免疫抑制药物，会限制异体骨移植的临床应用和效果。

Riggenbach等报道对19例锁骨骨折骨不愈合患者采用切开复位内固定结合异体骨移植治疗，16例患者达到临床治愈，提示异体骨移植对此类病例的效果尚好。有人做了异体移植骨的基础上覆盖骨膜瓣的临床试验，想解决成骨不良或者溶骨过快的问题，效果不尽人意。

胚胎骨移植是异体骨移植较好的应用领域，胎儿血中含有大量的免疫抑制因子能弥补异体骨移植造成的免疫排斥问题。另外胚胎骨缺乏板层骨，骨小梁吸收腔较大，基质充分，有利于血管长入和间充质细胞填塞从而诱导骨能力较好。低分化的细胞成分具有极强的生命力，有机质含量较成人丰富，提供较好的骨生长环境，所以胚胎骨移植也会是一种有前景的异体骨移植。

骨组织工程与基因工程的应用

自体和异体骨移植技术不同程度的修复了骨缺损，仍达不到最理想的修复层次，目前研究最热门的是骨组织工程联合前沿的生物材料和细胞生物学技术试图达到理想层次骨修复，将损失减少到最小。

组织工程修复骨缺损进展

骨组织工程可追溯到urist1965年报道的用DBM(骨形态发生蛋白)诱导间充质细胞形成进而分化为成骨细胞。直到1987年在美国纽约的学术会议上才正式提出组织工程学定义，其目的和意义是在细胞水平和分子水平构建具有生命力的细胞生物材料复合体，从形态、结构和功能上对缺损或功能障碍的组织、器官进行永久性地置换及替代，实现组织器官的形成及再生。组织工程学的不断创新使骨缺损的研究有了突破，使得骨移植后有骨生成、骨诱导、骨重建、骨修复作用。目前，骨组织工程学有不同的复合形式，生物材料复合成骨细胞和生长因子则是近年来的研究热点。

近年来骨组织工程所用的生物材料也是多种多样，各具特点，与骨组织工程、基因工程联合应用研究越来越多，可以做到互补。如陶瓷材料的生物力学性能和骨诱导不足可以被转基因处理的细胞分泌生长因子所弥补，生物材料可增加骨传导和稳固性，提供适宜的环境促进细胞增殖与分化。Dupont等用合成支架涂层联合腺病毒承载的BMP-2用于修复骨缺损，结果显示复合生物材料脱细胞移植有良好的骨诱导能力。

生物陶瓷独特的多孔结构模拟骨松质可以加速缺损部位的血管化有利于运输营养，加上生物材料本身不同程度的可溶性和降解性，可有不同时间段的吸收后骨重建。目前，研究最多的陶瓷材料是多孔性的羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)，它同生物玻璃都属于活性生物陶瓷。

由于HA的强度并不高，多用于强度较低的骨缺损修复，如颌面部外伤缺损。珊瑚是HA的代表，近年来仅作为填充物应用于临床，而忽视了其可作为生物工程支架和载体的作用。另外一种广泛应用的是β-磷酸三钙(β-TCP)，其最大的优势是植入机体后生物相容性好，所以也称为生物吸收性材料，局部反应和全身毒性反应都比较少见，降解的速度也较HA较快(主要与TPC的表面结构，晶体类型与比例，孔隙率和临床科研的动物有关)。

孔隙率是75%的TPC是最好的骨替代材料，但同样是因为强度不够，而只能用于不负重骨部位。磷酸钙陶瓷在体内的代谢途径目前认为是粒子而不是离子，所以长时间聚集可能会造成淋巴结增生。磷酸钙骨水泥可用作复合材料成分之一，承担组织工程中载体作用，显示出在细胞保护、增殖、碱性磷酸酶与骨胶原生成等方面的良好效果。通过向磷酸钙陶瓷中添加相应增强韧性的材料而形成的TPC复合材料已经成为研究热点之一，伴随着纳米技术的引入，该种材料的学术研究和市场都会有广阔的前景。

复合生物材料用于骨组织工程也能表现一定的作用。高分子聚合物可赋予骨基质各种理化和力学特性，可分为天然聚合物如纤维蛋白、甲壳素及其衍生物和合成聚合物如乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)。骨胶原(Collagen)是骨细胞外基质成分，可以促进钙沉积，血管内向性生长及生长因子锚定，促进骨愈合，是良好的细胞、药物、基因、蛋白支架，也常作为黏合剂与具备骨传导能力的载体，如羟基磷灰石或磷酸三钙等合用发挥各组分的优势。

王浩等将鼠间充质干细胞种植在骨胶原-羟基磷灰石-硫酸软骨素复合材料上，并在体外培养增殖，再将该复合物植入大鼠肌肉内。结果显示该复合材料的三维微孔结构可促进细胞向内生长，其在大鼠肌肉内逐步降解的同时伴有新骨形成，提示该复合物在细胞附着与诱导分化上有着良好表现。

目前用于骨组织工程的目的细胞有:成骨细胞(胚胎骨或新生骨、骨膜)、软骨细胞、骨髓基质干细胞(BMSC)、人脐带间质干细胞(HUCMSCs)、脂肪干细胞(ADSCs)、胚胎干细胞(ESCs)、转基因细胞等，大多是自体细胞，它们能大量分泌生长因子且有多分化潜能，如将BMP基因转染软骨细胞后可促进Ⅱ型胶原、软骨寡聚蛋白等的分泌。

BMSC存在成体骨髓内，在一定的条件下可向骨、软骨、脂肪三系分化，培养扩增几亿倍仍可保存其分化潜能，也能长期稳定的表达外源性生长因子基因。Corn等人用荧光成像的方法证实了间充质干细胞在移植后的修复作用。HUCMSCs的选择主要集中在足月新生儿，它的特异性抗原标记仍不明确，所以移植后的效果评价还停留在流式细胞术阶段。ESCs在表现其强大优势时也暴露其负面的遗传性，如携带致瘤基因，所以在未找到消除消极因素前可能会限制该细胞在临床上的应用。

ADSCs体外培养易成活，免疫特性低，还具有刺激组织细胞分泌血管生长因子作用而被广泛认可，其发展也最有前景。成骨细胞因易老化等缺点而被淘汰。尽管伦理、干细胞界定、分离和增殖上仍有挑战，但干细胞在组织再生方面的临床价值值得探索。

基因工程修复骨缺损进展

1973年开始，基因治疗已经不局限于遗传病的治疗，随着对生长因子基因的不断认识与克隆，人们想到将内源性生长因子稳定有效地表达在骨缺损部位用于骨愈合的治疗，尤其是在缺乏血管和神经的关节软骨缺损修复过程中应用更为必要。Sheyn等将基因修饰的干细胞用于椎体骨修复的模拟实验结果显示骨缺损得到良好修复，弥补了外科手术的不足。

治疗骨缺损基因工程所需要的目的基因主要是一些生长因子基因:骨形态生成蛋白(BMP)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF-A、B、E促进血管以出芽的方式生成，VEGF-C、D则促进淋巴管生成)、甲状旁腺素(PTH)等。

目前，已经认识到骨缺损愈合的过程中是多种生长因子共同参与、协同作用，共同促进愈合。已经有实验证明多生长因子基因联合作用较单个基因在促进成骨时更有效。研究最多的是BMP超家族的成员，它是骨修复生长的启动基因，诱导成骨细胞生成，对未分化的骨髓干细胞有促进增殖和分化的作用，对成熟的细胞无作用。同时能促进骨折部位的稳定，即使在炎症因子存在时也能显著诱导骨基质形成。BMP通过细胞膜上的Ⅰ型、Ⅱ型受体(都是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶超家族成员)，在细胞外聚集并通过Smad将信号转入胞内，引发骨生成。

例如，将外源性BMP2基因转染从机体上分离出的靶细胞，进行体外培养，然后再转移到缺损部位进行骨诱导修复即体外转染途径，或者基因表达载体直接注入机体靶细胞促进修复即体内转染途径。转染BMP2基因常选用的载体有病毒载体如腺病毒(a-denovirus，Ad)和非病毒载体如pcDNA3、pBK-B2、pEGFP等。

YossiGafni等利用腺病毒载体转染大鼠的骨髓基质细胞，利用骨缺损处成骨反应时产生的放射线观察得到证实。Clements等用载有碱性生长因子的质粒转染BMSC结果证明了非病毒载体的可行性。相比较而言体内转染途径在临床上更容易实施，因体内转染途径不仅能较好表达生长因子且能避免病毒传播和免疫反应的副作用。

只是在临床中会遇到这样的问题:注射到局部的BMP会被渗出的体液冲散而引来吞噬细胞且靶细胞的选择不容易控制，降低了生长因子的作用效率。

目前采用超生介导的体内转染操作简单可指导临床应用，体外转染也有其明显优势，高效的细胞转导，操作简便，还可与骨组织工程结合来完成骨修复，将来源于自身组织的细胞复合组织工程载体，然后经过细胞生物反应体系培育，再转移到宿主能够减少生长因子被蛋白酶水解提高移植质量，如rhBMP-2联合胶原蛋白海绵载体，但BMP-2用量会是生理需要的1000倍，带来经济负担和不良反应如水肿、异位成骨等。于是，有人选用与BMP-2生物活性相似的生物活性肽P24来代替rhBMP-2，实验结果表明有明显的成骨效应。需要注意的是，不是越多的生长因子表达就越好，如VEGF过度表达会引发骨重建环境的不稳定，增加骨降解。

载体承担传递基因的作用，要根据骨缺损的大小、位置等来选择合适的基因工程载体。病毒载体以腺病毒(Ad)应用最多，因为本身就具有致病性所以制备起来复杂，安全度低且有免疫反应(原因是病毒表面的抗原暴露在靶细胞的表面)，但转染率高还能控制BMP的过量表达。有人用药物来阻止免疫反应从而减轻病毒载体的免疫损害，结果显示免疫抑制后靶细胞仍然可以表达目的基因进行骨诱导。

而非病毒载体虽然低毒、不会引发较强的免疫反应，也比较稳定可重复多次使用，但转染率相对较低。有文献报道生长因子表达的时间和量都是影响基因治疗的因素，所以新开发的慢病毒介导BMP2表达时间要长于Ad介导的表达时间。

基因转染的生化方法主要有磷酸钙介导的转染、二乙氨乙基聚糖介导的转染(DEAE)及脂质体介导的转染等。其中，由脂质双分子层组成环状封闭囊泡的脂质体多用，它与DNA形成脂类复合物，通过入胞方式使基因转入细胞。不同的脂质体也有不同特点，Lipofecamine对于一些难转染的细胞转染效率高，但细胞毒性较大；Fugene6细胞毒性小，转染效率高，操作简单，已经占了主导地位。当然，转染也有物理方法，包括电穿孔法和显微注射法，后者就是直接用微吸管吸取DNA液，在显微镜的帮助下，注射到目的细胞或者靶细胞的细胞核中，操作的技术要求较高。

两种方法的联合应用

组织工程在骨缺损修复中虽然有前景，但目的细胞在体外培养时极易老化，从而丧失增殖和分化能力。所用目的细胞体外培养的需要量大，且必须加以诱导才能促使其向成骨细胞分化，而多次注射生长因子代价也会很高。基因工程虽然在骨诱导方面有很大的优势，但是体内转染途径的靶细胞不好定位，体外转染途径若是不联合骨组织工程，缺损部位的骨强度不够会影响近期支撑功能。

目前采用基因工程联合骨组织工程可以有效防止细胞老化，并且能使细胞长期有效地表达生长因子，避免重复注射生长因子，而且基因工程所表达的是内源性的生长因子，生物活性比外源性的更强，更有利于干细胞向成骨细胞的分化，加速新生骨的形成，另外组织工程也可弥补基因工程骨传导不良的缺陷。大片移植骨时，即使是运用了各种有孔生物支架或是直接将内皮细胞和骨髓干细胞放在试管内培育，工程骨的血管生成与骨诱导同时有效仍然是个没有攻克的难题，难免会顾此失彼。

最近有报道将ＲunxⅡ基因转染的脂肪干细胞联合血管束一同移植到骨缺损部位结果显示有良好的骨再生和血管形成能力，所以虽然两种工程看似是单独个体，却可以联合起来引领骨缺损的治疗方向。

展望

综上所述，人类在骨缺损修复治疗上已经有新的突破，最近胸腺肽-β、整合素α5等也被挖掘认为与骨再生有关，可见未来会有更多的积极因素被发现，只是不同的研究方法仍然存在需要解决的问题。很多成果都仅在动物模型上获得了成功，缺乏临床研究的实验数据。

在生物陶瓷方面，第一，孔型结构有很多优势但也要知道这种结构会造成氧自由基、代谢物的四处扩散；

第二，依照全身不同部位的骨骼特性，使陶瓷材料在制作加工的过程中，在结构、化学物质组成、性质都尽量的符合骨骼愈合过程中的变化，即让材料在移植之后能完成一种由无生命到有生命的蜕变过程，这种过程包括材料降解之后在体内的分布和代谢；

第三，生物材料的脆性和疲劳性也是一个需要解决的问题。组织工程与基因工程所用的干细胞的成骨诱导作用，在3D结构支架上的加强和引导也是一个难题。

目前，无论是组织工程、基因工程还是骨移植材料都没有一个具体的标准来衡量治疗的安全性和长期有效性，如基因转染的剂量控制标准、负面影响目的细胞增殖分化的生物因子量如白介素4等。有人研究用磁场和低能量脉冲超声波来治疗骨折不愈合和骨缺损，可能与DNA结合抑制因子(Id4)有关但确切的机制还不清楚。即使有许多问题都还有待于解决，但是新技术的前景是无法估量的。所有的技术都不是孤立存在的，将各种方法联合起来应该是一种治疗方向。