中国人常见GJB2基因突变蛋白滞留内质网

张小盒 · 发表于 2014-12-2 20:29

【摘要】
目的：6个Connexin单体亚单位翻译后进入高尔基体和内质网进行组装，形成同型或异型Connexon，然后通过微管系统运输到包膜上与相邻细胞膜上的对应Connexon构成一个完整的缝隙连接通道。其中内质网中进行的二硫键形成是蛋白组装的一个重要环节。通过质量控制机制，错误折叠的的蛋白可能被运输到内质网外的细胞基质中进行降解，但GJB2基因突变蛋白在细胞内的代谢还不完全清楚。本研究构建中国人常见GJB2基因突变c.235de1C、c.299-300delAT和c.176-191de1（16bp）与增强型绿色荧光蛋白的融合蛋白（EGFP）表达载体并在HEK293细胞中表达，选用内质网特异性染料衬染阳性转染细胞，研究突变蛋白的细胞内代谢途径，推测上述三种突变形成的多肽链在细胞内可能存在的部位，进一步探讨中国人常见GJB2基因突变致病机制。
方法：用体外定点突变法构建c.235de1C、c.299-300delAT和176-191de1（16bp）突变全序列与EGFP表达载体，以此为模板PCR扩增突变有效表达序列，将PCR产物连接到pMD19-T载体中，EcoRI/BamHI双酶切克隆载体，测序鉴定序列正确性后，将酶切产物插入pEGFP-N1载体中，脂质体转染HEK293细胞，转染48h后，用胰蛋白酶消化细胞，在含有G418(350μg/ml)的选择性培养基中筛选2周，扩增培养形成稳定表达中国人常见GJB2突变的HEK293细胞系。培养细胞至70％融合，加入ER-Tracker™红色荧光染料37℃孵育30min，激光共聚焦显微镜观察突变蛋白亚细胞定位情况。
结果：GJB2基因突变c.235de1C、c.299-300delAT和c. 176-191de1（16bp）在HEK293细胞中高效表达，表达主要位于细胞质中，与内质网特异性染料染色高度重叠。
讨论：中国人常见GJB2基因突变c.235de1C、c.299-300delAT和c. 176-191de1（16bp）由于缺失1个或多个碱基导致移码突变，使序列中提前出现终止密码子，使翻译后仅有80、112和75个氨基酸的截短多肽链形成，使Connexin缺乏重要功能区，难以形成蛋白质二级和三级结构，使蛋白丧失细胞膜定位能力，同时突变蛋白的结构变化可能被细胞的质量控制所机制识别，突变蛋白被滞留在内质网中，细胞可能通过本身处理错误折叠多肽链的途径将突变蛋白进行降解，最终的结果是细胞膜上缺少缝隙连接，可能是导致耳聋的主要原因。