葡萄糖转运蛋白-1反义核酸对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

张小盒 · 发表于 2014-12-10 13:47

[摘要]
目的  观察反义Glut-1对Hep-2细胞增殖、Glut-1的表达情况及葡萄糖吸收的影响。
方法  克隆Glut-1基因，将Glut-1cDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA3载体，构建反义Glut-1表达载体反义 Glut-1pcDNA3（＋）载体，利用阳离子脂质体载体，稳定转染人喉癌Hep-2细胞，并通过MTT法检测葡萄糖刺激的Hep-2细胞存活率及葡萄糖摄取的影响，用RT-PCR法检测Hep-2细胞的Glut-1的表达情况及用Western Blot法检测Glut-1蛋白表达情况。
结果  成功克隆了Glut-1基因，并构建了携带反义Glut-1基因的真核表达载体反义 Glut-1pcDNA3（＋）载体，将其稳定转染人喉癌Hep-2细胞，获得了稳定表达反义Glut-1的细胞系，反义Glut-1pcDNA3载体的Hep-2细胞葡萄糖的吸收明显减少及Glut-1的表达明显降低。
结论  反义Glut-1基因转染可以有效地抑制喉癌Hep-2细胞的Glut-1的表达及葡萄糖的吸收，抑制喉癌Hep-2细胞的生长，以Glut-1作为靶点,阻断Glut-1的表达，为一种新的喉癌治疗策略。
关键词：反义葡萄糖转运蛋白-1；基因转染；喉癌
The effect of antisense glucose transporter-1 on cell proliferation and glucose intake of laryngeal carcinoma cell line  ZHOU Shui-hong *, CHENG Ying,,FAN Jun, CHENG Xiao- ming, WANG Sheng-qing, CHENG Ke-jia, WANG Qin-ying. Department of Otolaryngology, First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310003, China.
Abstract Objective To study the role of antisense oligonucleotide (ASODN) Glut-1 in inhibition of proliferation , expression of Glut-1 and glucose intake of laryngeal carcinoma cell line. Methods Glut-1 gene and ASODN Glut-1 sequence was amplified by PCR. The expression plasmid pcDNA3.1(+)-Glut-1 and pcDNA3.1(+)-anti Glut-1 was constructed. MTT [32-(4, 5-dimethyldiazol-2-yl) -2, 5 dipheny tetrazolium bromid]method was used to observe the cell growth inhibitory rate, the expressions of Glut-1 mRNA and protein were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot respectively. Results he plasmid pcDNA3.1(+)-anti Glut-1 indicated that the vector could successfully express the anti Glut-1 gene by PCR and DNA sequencing and successfully transfected to Hep-2. The mRNA expression of the anti Glut-1gene was detected in the Hep-2 cells transfected. Glut-1 ASODN obviously inhibited the glucose uptake and the cell growth of Hep-2 cells after transfection. After transfected with Glut-1 ASODN the expressions of Glut-1 mRNA and protein of Hep-2 cells were down-regulated. Conclusions　 Glut-1 ASODN could inhibit the glucose uptake and the  proliferation of Hep-2 cell  through down-regulating the expressions of surviving mRNA and protein.Glut-1 mRNA could be a target for cancer therapy, especially foe cancer cells overexpressing Glut-1.
Key Words antisense oligonucleotide glucose transporter; gene transfection; laryngeal carcinoma;Hep-2 cell line
葡萄糖转运蛋白（Glucose transporter protein ,Glut）是介导细胞葡萄糖摄取的主要载体。与正常细胞、组织及良性病变相比，恶性肿瘤细胞对葡萄糖的代谢率增高。国内，我们首先发现Glut-1在头颈部鳞状细胞癌中的表达增高，并发现Glut-1的增高与头颈部鳞状细胞癌的淋巴结转移、临床分期有关[1]。一些头颈部恶性肿瘤中也发现Glut-1的高表达与头颈部鳞状细胞癌的放化疗抵抗及预后差有密切关系[2-3]。因此，我们推测Glut-1可以作为恶性肿瘤治疗的理想靶点。为了进一步研究Glut-1对喉癌细胞的作用与生物学功能，我们成功构建了Glut-1反义寡核苷酸( antisense oligonucleotide, ASODN)真核表达质粒，并探讨反义Glut-1对喉癌Hep-2细胞的葡萄糖吸收的影响及对Hep-2细胞增殖抑制的可能机理。
材料和方法
  1.实验材料
1.1试剂及引物：喉癌细胞株Hep-2细胞购自上海中科院细胞所。pcDNA3.1载体，两种限制性内切酶（HindIII、Xba I），T4连接酶购自TAKARA公司，PCR试剂盒购自上海之江生物科技有限公司，引物由上海鼎安公司合成。引物Glut-1Forward：5’-cccaagcttATGGAGCCCAGCAGCAAGAAG-3’，Glut-1 Reverse：5’-tgctctagaCACTTGGGAATCAGCCCCCAG- 3’，含酶切位点HindIII识别序列A^AGCTT，含酶切位点Xba I识别序列T^CTAGA；全长扩增1479bp；反义-Glut-1Forward：5’-tgctctagaTTTATTGCAGCCAGAGCCACCAGCG-3’，反义Glut-1Reverse：5’-cccaagcttACAGAAAAGATGGCCACTGAG-3’，含酶切位点Xba I识别序列T^CTAGA，扩增片段250bp；Glut-1逆转录引物Forward：5’-GTCTGGCATCAACGCTGTCT-3’， Glut-1逆转录引物Reverse：5’-ACCACACAGTTGCTCCACATAC-3’， RT-PCR长度339bp；GAPDH Forward：5'-GTCGGTGTGAACGGATTT-3'，GAPDH Reverse：5'-ACTCCACGACGTACTCAGC-3'，扩增长度276bp。
2.实验方法：
2.1 Glut-1 ASODN 构建、鉴定、质粒转染和阳性细胞的筛选：进行pcDNA3.1载体PCR扩增鉴定；正义pcDNA3.1-Glut -1载体构建、鉴定；
2.1.1反义寡核苷酸pcDNA3.1(+)-Glut -1载体构建、鉴定：将Glut-1反义寡核苷酸的PCR产物与载体pCDNA3.1+分别用Hind III和Xba I进行双酶切，并用凝胶回收试剂盒回收。酶切后，载体和片段用T4 DNA 连接酶连接过夜，连接产物命名反义pcDNA3.1-Glut(+)，转化到DH5α中，涂于氨苄阳性板中，挑取阳性克隆并增菌，抽提质粒进行鉴定。用PCR扩增鉴定，Hind III和Xba I双酶切鉴定，最后用测序法测序基因序列准确性。取上述基因组抽提物于40μl反应体积中进行PCR反应。
2.2.2质粒转染和阳性细胞的筛选：转染：将Hep-2细胞接种于6孔板中，按转染试剂盒lipofectamine2000操作说明书进行操作，同时设立pcDNA3.1(+)空载体组和pcDNA3.1(+)-反义Glut-1组，转染4小时后换完全培养基，24小时后加入1200ug/mlG418进行筛选。两周后传代，继续用含G418的培养基培养，收集一定量细胞后用PCR（DNA水平）进行鉴定。
2.2.3 Hep-2-pcDNA3.1(+)空载体鉴定、表达检测：取上述基因组抽提物于40μl反应体积中进行PCR反应。反应体积组成如下：10× Buffer 4μl、dNTP 10mM/L(0.8μl)、MgCl2 25mmol/L (3.2μl)、5U TaqDNA多聚酶(0.3μl)、模板4μl、上、下游特异引物各1μl、去离子水25.7μl。先在94˚C变性3min,然后按下述条件循环35 次，变性94˚C 20s、退火58˚C 20s、延伸72˚C 30s，最后72˚C延伸5min, 4˚C冷却5 min结束反应。琼脂糖电泳。
总RNA提取：收集铺板葡萄糖作用后的各组细胞，加1ml Trizol于冰水上充分裂解，常规提取。逆转录反应：上述细胞中提取的2μg总RNA在20μl反应体系中逆转录成cDNA,该反应体系组成如下：5×RT-Buffer 4μl, oligd(T) 2.5μmol/L, dNTPs 5mmol/L, RNAasin (RNA酶抑制剂) 20U。
2.2 MTT法检测葡萄糖刺激的细胞存活率
在正常Hep-2细胞、Hep-2-pcDNA3.1（+）细胞、HEP-2-pcDNA3.1(+)-反义Glut-1细胞生长状态好的时候铺一块96孔板。Hep-2细胞1.0×104/孔， Hep-2-pcDNA3.1（+）细胞、Hep-2-pcDNA 3.1（+）-反义Glut-1细胞1.5×104/孔。
铺板后第二天分别用葡萄糖刺激。设立组别：medium、1mmol/l、 5 mmol/l、 10mmol/l 、15 mmol/l、20mmol/l 、25mmol/l七个浓度。葡萄糖刺激48h后，加入MTT，然后在细胞培养箱中培养4h后弃上清，每孔加入150ul DMSO，在37℃摇10min后在酶标仪上读取数据。
2.3葡萄糖刺激实验
2.3.1细胞培养：
在正常Hep-2细胞、Hep-2-pcDNA3.1（+）细胞、Hep-2-pcDNA3.1(+)-反义Glut-1细胞生长状态好的时候各铺两块六孔板。 Hep-2细胞6.5×105/孔， Hep-2-pcDNA3.1（+）细胞、Hep-2-pcDNA 3.1（+）-反义Glut-1细胞7.0×105/孔。
铺板后第二天分别用葡萄糖刺激。设立组别：5mmol/l、10 mmol/l、 20mmol/l三个浓度。每种细胞各三个浓度，葡萄糖分别刺激0.5h、1h后，分别收集培养上清、RNA和蛋白。-20℃保存用于实验检测。
2.3.2Hep-2细胞培养上清葡萄糖吸收含量测定
使用科华生化检测试剂盒检测葡萄糖作用后的细胞培养上清中的葡萄糖浓度，按照试剂盒操作说明书进行。
G418培养基葡萄糖(glucose, Glu)浓度：11.23mmol/l，1640培养基葡萄糖浓度：10.31mmol/l。
计算公式：
Glu摄取量(mM)＝Glu刺激浓度(mM)＋培养基浓度(mM)－培养上清Glu浓度（mM）
2.3.3. RT-PCR法检测Glut-1mRNA的表达情况
采用RT-PCR检测Glut-1mRNA、GAPDH的表达。逆转录反应：用细胞中提取的2μg总RNA在下述20μl反应体系中逆转录成cDNA,70˚C预变性5min，然后加入M-MLV逆转录酶200U(Promega公司)， 42˚C孵育1小时，72˚C加热10min灭活逆转录酶。取上述逆转录反应产物于40μl反应体积中进行PCR反应。先在94˚C变性3min,然后按下述条件循环30 次，变性94˚C 20s、退火57˚C 30s、延伸72˚C 30s，最后72˚C延伸10min, 4˚C冷却5 min结束反应，电泳。
2.3.4Western Blot法检测Glut-1蛋白表达情况
细胞用PBS洗涤一次，加入100μl/孔（6孔板）蛋白裂解液，冰上放置10min，用细胞刮刮下细胞，4˚C低温离心12000转/min×10min，吸取上清到新鲜Eppendorf管中。用BAC蛋白定量试剂定量，取总蛋白80ug上样进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到硝酸纤维素膜上。封闭液（1×TBST，5%脱脂奶粉）室温封闭2小时，加一抗（1：500）室温孵育3小时，二抗（1:1000）室温孵育1小时，各阶段分别用1×TBST洗涤三次，每次10min，最后ECL显色，暴光，显影，定影，分析。
3.统计学分析
所有数据经 Excel 软件整理，应用SPSS15.0 版统计软件进行分析。计量资料数据以 x ±s 表示，用方差分析及两样本均数比较的 t 检验进行统计分析。以双侧 P≤0.05 为差异在统计学上有显著性意义。
结果
1.Glut-1的PCR产物、正义pcDNA3.1-Glut-1（＋）质粒克隆与酶切鉴定、基因测序：Glut-1的PCR产物（图1）：PCR大小约1500bp。pcDNA3.1－Glut（＋）质粒克隆与鉴定：用PCR扩增鉴定（图2）及酶切鉴定（图3），大小均为1500bp。pcDNA3.1-Glut（＋）质粒测序：用测序法测序基因序列准确性（图4，测序引物pSec-1和pSec-2）。与Genbank中Glut-1 （序列号：5730050）序列同源性为100％。