喉癌Hep-2细胞系CHFR基因表观遗传调控对其mRNA表达的影响

张小盒 · 发表于 2014-12-9 16:38

摘要
目的：探讨DNA甲基化，组蛋白H3-K9乙酰化在喉癌Hep-2细胞系CHFR基因mRNA表达中的调控作用，从而探讨CHFR基因mRNA表达与DNA甲基化，组蛋白H3-K9乙酰化的关系。
方法：1.细胞培养及实验分组：Hep-2人喉癌细胞按常规培养于含10％胎牛血清RPMI-1640的培养液，NaHCO2浓度2g/L，青霉素G浓度100U/L，链霉素浓度100μg/L，37℃含5％CO2的湿润空气的恒温密闭式培养箱培养。分成四组，分别应用5-Aza-dC及TSA干预。(1)加1μmol/L 5-aza-dC培养72小时；(2)加TSA300nmol/L培养24小时；(3) 加1μmol/L 5-Aza-dC培养48小时后加TSA300nmol/L继续培养24小时。2.实时定量PCR 检测CHFR基因mRNA表达：收集细胞，TRIzol试剂提取总RNA，反转录合成cDNA ，然后以SYBR Green I 荧光法进行实时定量PCR扩增，以GAPDH为内参，由PCR 反应曲线得到Ct 值，采用2-△△ct方法进行相对定量，实验重复三次，取其平均值进行分析。 3.甲基化特异性PCR检测CHFR基因DNA甲基化：收集细胞，酚一氯仿抽提法提取基因组DNA。紫外分光光度仪定性、定量。亚硫酸氢钠修饰DNA, Wizard DNA Clean-up Systerm纯化。离心沉淀DNA。采用甲基化特异性PCR方法，甲基化酶处理的和未处理的正常人的外周血细胞分别为阳性和阴性对照。琼脂糖凝胶电泳，EB染色。实验重复三次，取其平均值进行分析。4.染色质免疫沉淀（CHIP）检测乙酰化H3K9水平：收集细胞，甲醛交联组蛋白和DNA。裂解缓冲液悬浮细胞，其中一部分作内对照，第二部分加H3K9乙酰化抗体，第三部分加正常兔IgG作阴性对照，收集抗体/蛋白复合物，分解交联物，酚/氯仿法提取DNA，行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。以基因与内对照条带的光密度比值作为分析指标，实验重复三次，取其平均值进行分析。
结果：在对照组Hep-2人喉癌细胞系中CHFR基因启动子区显示DNA甲基化，同对照组比较，用5-Aza-dC作用后DNA甲基化程度明显减弱，mRNA表达量上调（1.75±0.21），而组蛋白H3-K9乙酰化程度无明显变化。用TSA 作用后DNA甲基化程度和mRNA表达量（1.05±0.13）无明显变化，而组蛋白H3-K9乙酰化程度增加。联合使用5-Aza-dC+TSA后DNA甲基化程度明显减弱，mRNA表达量明显上调（2.15±0.18），组蛋白H3-K9乙酰化程度增加。
结论：在Hep-2人喉癌细胞系中CHFR基因启动子区DNA甲基化和组蛋白H3-K9乙酰化程度与CHFR基因mRNA表达水平有关，二者在CHFR基因表达调控中起拮抗作用，DNA甲基化的作用更为重要。5-Aza-dC和TSA分别能够调控CHFR基因启动子区DNA甲基化和组蛋白乙酰化程度，从而影响其基因表达，这种可逆性特征可能为临床使用药物治疗喉癌提供了新思路。