口腔组织工程

小成 · 发表于 2007-11-16 14:37

口腔医学作为生命科学的一个重要分支，与组织工程学有着不可分割的渊源。欧、美、日等国家都是率先由口腔组织入手进行人体组织工程研究和临床应用的。由于口腔领面部各组织器官在结构和功能上的特殊性，决定了其不同于机体其他部位的组织工程学研究特点。

1.牙齿组织工程

是由位于领骨内的牙胚组织缓慢发育形成的高度分化的组织器官发育成熟的牙齿，包括牙体和牙髓两大组织。众所周知，人的一生只能有两副牙齿，乳牙脱落后更换为恒牙，而恒牙缺失后将不可能再生，只能用修复替代等方法恢复缺失牙的咀嚼功能和美观。目前，科学家们正在致力于寻找牙齿再生的可能性。组织工程定制牙齿将淘汰假牙，牙齿更新将随心所欲，这将是现代组织工程科学向口腔疾病治疗的传统观念和方法的最具革命性的挑战。

目前的主流观点认为，在牙发育的初始阶段，口腔粘膜上皮中存在携带诱导牙发生信息的上皮条索。该上皮可以诱导鳃弓中的间充质形成牙间充质，而后两者可以相互作用，诱导牙发育的完成。虽然这一观点的正确性仍需进一步证实，但有一点是明确的，即对于牙组织工程而言，至少需要2种细胞：牙上皮细胞和牙间充质细胞

1.1牙组织工程的细胞来源

1.1.1牙源性细胞

1.1.1.1牙上皮细胞  由于成釉器在釉质形成后逐步消失，因此用以进行成釉器重建的细胞来源和方法是牙组织工程的最大难题之一。虽然已有的研究[112]发现：在鼠类的切牙颈环部位存在上皮干细胞，但目前牙组织工程的难点在于如何寻找成体细胞进行成釉器的重建。

1.1.1.2牙乳头(牙髓)细胞  目前的研究已明确，在人牙髓中存在干细胞，但这些细胞的来源尚不清楚，目前尚无将其用于牙组织工程方面的研究报道。新近报道牙乳头细胞可以诱导毛囊组织生长，提示牙乳头细胞也可用于牙再生[113]。

1.1.1.3牙周细胞  Saito等[114]新近报道，在成体牙周组织中存在干细胞，这些细胞可以被诱导形成成牙骨质细胞。但是由于目前对牙发育中成牙骨质细胞的来源以及牙骨质产生的机制仍有分歧，这些细胞的特性有待于进一步研究。

1.1.2非牙源性干细胞

Modino等[115]的研究表明：成体骨髓基质干细胞可作为牙间充质的替代物，与胚胎牙上皮作用，形成牙胚。这是目前唯一被证明可以被用于牙组织工程的非牙源性细胞。如果这一结果可以被重复，则表明牙再生时间充质细胞的来源已得到了解决。但该实验的局限性是必须使用牙发生初始期的牙上皮，而胚胎期牙上皮与成体骨髓基质干细胞相互作用，诱导其形成牙间充质的机制尚不明确。

1.2 牙组织工程中的生物支架

人造生物支架被认为是组织工程学必不可少的手段之一，但迄今尚很少有使用预成外形的人工生物支架进行器官再造的成功报道。在生物体的生长发育过程中，细胞间的连接及细胞外基质构成了天然的“生物支架”，这些“支架”在组织及器官形成和行使正确的生物学功能方面起着重要作用。

1.3体内或体外器官培养

牙组织工程目前常用的手段是将人造生物支架或者重组体直接植入体内，虽然宿主可为植入体提供良好的营养供应，但已进行的有关实验中，宿主组织对于新形成的牙的结构和功能上的影响并不明确。在已发表的直接体内移植实验报道中，尚无有关移植体可以形成拥有正常外形的牙的报道。同时，直接移植到下颌骨或者腭粘膜中的牙胚[116]均无法生成牙根并萌出。目前的直接移植实验除了下颌体外，为了获得最大限度的营养供应，大多数学者采用眶内和肾囊内移植的方式进行体内培养。这些部位虽然可以提供丰富的营养物质，但在实际的临床应用中均不可行。这些都表明，直接移植方式有很大的局限性。

2.牙周组织工程

2.1生长因子与牙周组织工程

与牙周组织再生相关的生长因子主要有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨诱导形成蛋白(BMPs) ,釉基质蛋白(enamel matrix proteins , EMPs)、IGF、PDGF和TGF-β等。

动物实验表明，局部应用外源性的bFGF能明显促进牙周膜、牙骨质和牙槽骨的修复重建[]。BMP可促进PDLCs增殖和DNA合成，升高PDLCs的碱性磷酸酶活性，能诱导牙周组织中未分化间充质细胞分化为成牙骨质细胞和成骨细胞；Richmon等[117]利用基因转染技术获得稳定表达具有 BMP生物活性的种子细胞，体外将此细胞与明胶复合，修复鼠牙槽骨人工缺损取得成功，为BMP在牙周组织工程中的应用开辟了新的研究空间。

2.2 牙周组织工程的种子细胞来源

PDLCs直接来自牙周组织，有很强的分化增殖能力，而自体PDLCs植入可避免免疫排斥反应，故目前牙周组织工程方面的研究多采用自体PDLCs作为种子细胞。但因其来源有限，对同种异体或异种PDL Cs以及牙周膜细胞系或基因工程化PDL Cs的研究已逐渐受到关注。GFCs作为牙周组织的组成成分，来源丰富、容易获得、具有很强的生长和自我繁殖能力，在适当的刺激下，可表达成骨细胞表型，有望成为牙周组织工程的理想种子细胞。MSCs具有多向分化潜能，在一定诱导条件下可分化为成骨细胞，应用于牙周组织工程的许多研究均取得成功[118]。

2.3 牙周组织工程生物载体支架材料

组织工程核心技术在于构建细胞与生物材料复合物。其中生物材料是构建组织工程化牙周组织的物质基础，细胞在支架材料中不断生长、增殖，并分泌细胞外基质取代逐渐降解的生物材料，最终形成具有活力的组织，修复牙周缺损，这方面的研究国内外才刚起步，大多数研究都集中于把组织工程其他领域的支架材料直接或通过简单的表面修饰用于牙周组织工程。体外培养将动物自体PDLCs接种到纳米羟基磷灰石材料三维支架上，观察细胞生长、增殖及附着情况，结果提示支架材料与细胞相容性良好，动物实验可见将此细胞与支架材料复合体植入人工牙槽骨缺损可以获得比对照组更多的新生牙槽骨、牙周膜和牙骨质，缺损处牙周组织几乎完全再生[119]。

广义牙周组织工程学同样包括生长因子支架材料、种子细胞.支架材料和种子细胞。生长因子-支架材料3种构建方式，由于后两种构建方式用于临床还有许多问题(如种子细胞的来源、免疫原性等)不能解决，因此在牙周组织工程中，利用合适的载体材料携带外源性生长因子促进牙周组织再生报道较多。Holland等[120]已经成功地将bFGF的缓释延长到3-4周，将这些研究成果应用于牙周组织再生技术的研究，必将给GTR的治疗效果带来质的飞跃。

3.口腔骨组织工程

3.1骨组织工程的基础研究

3.1.1种子细胞  组织工程骨常用的种子细胞是骨髓基质干细胞，包括骨髓基质细胞BMSC和骨髓间充质干细胞。骨髓基质细胞常采用密度为1.077的Ficoll液离心分离或直接骨髓获取，原代培养，骨髓基质细胞形态多样。骨髓间充质干细胞一般用密度1.073的Percoll液分离获得。尽管骨髓基质干细胞有许多表面抗原和抗体，由于没有特异性的分子探针在原位识别它，所以还不能够确定它的精确的位置和数量。

3.1.2 调控因子  控制细胞增殖并向成骨方向分化的调控因子有很多，地塞米松、维生素C、维生素D3,β-甘油磷酸、IGF、PDGF和TGF-β、表皮生长因子等。这些调控因子通过不同的方式，对细胞的成骨起推动作用。

3.1.3 生物支架材料  在骨组织工程中，支架材料分为有机高分子材料和无机材料两大类，目前，尚没有一种材料能完全达到理想的要求。随着生物材料的相互作用机制的研究，已经从对材料机械强度、亲水性、可降解性和易加工程度等基本的理化和生物相容性的研究，发展到对其形状结构进行精密设计与加工，以及对生物材料表面的改造和修饰，赋予生物材料特定的生物活性和功能。

3.2 口腔颌面骨组织工程动物实验研究

3.2.1牙槽骨缺损修复牙槽骨是上下颌骨包围和支持牙根的部分，是一种高度可塑性的组织。因为牙周炎等各种疾病，导致牙槽骨的缺损。膜引导组织再生技术(guide tissue regeneration , GTR)在牙周膜手术治疗中，采用单纯的膜覆盖，主要依靠牙周膜细胞本身的成骨能力。随着骨组织工程技术的发展，联合应用外源性种子细胞、各种生长因子，对再生的组织成分进行主动的诱导分化，促进牙槽骨修复。以PLCA膜为rhBMP-2,rhBMP-7因子的缓释载体，放置于拂拂牙槽骨的缺损处，能明显促进牙槽骨再生。

3.2.2下颌骨的再建和修复  随着骨组织工程技术的发展，下颌骨的骨修复和重建不再局限于自体或者异体骨的移植。有人用骨髓基质干细胞和磷酸盐支架材料构建组织工程骨，修复羊的下颌骨部分缺损。下颌骨的缺损可以用自体骨髓基质干细胞构建的组织工程骨进行修复。牵引成骨技术借助外力刺激组织的生长和再生，治疗先天性和后天性骨畸形，这是一种典型的骨组织工程体内构建方式。对于下颌骨和软骨的复合损伤，也可以通过组织工程骨的构建来得到修复。实验表明，可降解的支架和骨髓细胞可以形成组织工程化的骨结构。由于体外构建很难完成较厚的组织培养，工程组织距离临床应用尚有一段距离[121]。

3.2.3上颌骨再建和修复  当上颌骨萎缩，传统采用自体髂骨移植作上颌窦提升术。对于上颌骨的先天或后天性的缺损，利用骨组织工程方法可以修复动物颚裂的骨缺损，并有可能应用到临床。研究结果表明MSCS / β- TCP复合物可以作为自体髂骨移植的替代物。

4. 口腔黏膜组织工程

目前对于黏膜缺损的修复基本采用皮肤移植和口腔黏膜移植的方法。但移植皮肤不会转化为黏膜，移植多年后仍保持上皮角化、分泌、毛发生长等特征，使患者倍感不适，不能满足临床需要；黏膜移植因黏膜来源有限，不能广泛应用。而且这些方法都需要开辟第二手术野。80年代以来，国内外用组织工程的方法修复口腔黏膜缺损，取得了一定的成果。

4.1 口腔黏膜支架材料

最早用作口腔黏膜组织工程的支架是3T3成纤维细胞滋养层，但因具有抗原性不能直接用于创面，使用时要经过酶消化后，才可用于体内；另外，培养瓶壁也曾被用作支架，同样要经过酶消化后才可用于体内。目前常用的口腔黏膜组织工程支架材料主要有下列材料。

4.1.1胶原  胶原是一类优良的可用于引导组织再生的生物材料，具有无抗原性、生物相容性好、可参与组织愈合过程等特点，在止血、促进伤口愈合、作为烧伤创面敷料、骨移植替代物、组织再生诱导物方面得到广泛应用。胶原是最多被用作口腔黏膜组织工程支架的材料，但胶原存在降解速度不可控制，机械强度小和种属间具有抗原性等特点。

4.1.2 其他支架材料  Risbud等利用具有生物相容性的水凝胶培养呼吸道上皮细胞，并对其性能作了研究，认为水凝胶是一种较好的上皮细胞培养支架。lzumi等以人尸体真皮为支架，在其上利用无血清培养基进行人口腔黏膜上皮细胞培养，构建组织工程化口腔豁膜。另外，也有利用人工合成材料用作黏膜组织工程支架的报道。

4.2 口腔黏膜组织工程的临床应用

组织工程化口腔黏膜可以用于先天性颚裂修补术、口腔肿瘤切除术后口腔缺损的修补术，以及牙周疾病的治疗[122]。利用组织工程技术体外培养黏膜角化上皮细胞局部移植，可有效解决颚裂成形术后因颚黏膜组织量不足而导致的瘢痕挛缩、骨面暴露和领骨发育受限的问题。有报道用纤维蛋白胶(fibringlue ,GL)与培养大鼠黏膜细胞共同覆盖同系动物颚裂手术时的裸露创面，结果表明明显促进了局部角化上皮修复和颚骨的再生并抑制了瘢痕的形成。研究认为体外培养的口腔黏膜上皮细胞还具有分泌、抑制瘢痕形成和防止创口收缩因子的作用。体外培养的自体口腔黏膜上皮细胞层已在临床直接移植至病损部位，并且取得了良好的治疗效果。研究中发现，体外培养的口腔黏膜上皮细胞较皮肤表皮细胞增殖能力高，易于体外扩增，更适宜作为体内移植用的组织来源。