流式细胞技术分析骨形成蛋白对人牙周膜细胞增殖和分化的影响

牙妹

作者：王勤涛　吴织芬　董广英　史俊南　出处：华西口腔医学杂志


摘要　目的:检测牛骨形成蛋白(bBMP)对离体培养的人牙周膜细胞(PDLC)的DNA合成和细胞周期的影响情况。方法:培养的第7代PDLC分成对照组和BMP作用实验组,以含1%FBS的DMEM培养72 h;消化下细胞,固定,调整细胞数在1×106/ml,加入复合DNA荧光检测试剂后4℃染色30 min,用流式细胞仪(FCM)测试,联机专用软件分析处理。结果:实验组PDLC的DNA合成量(S%)显著高于对照组;G1%较对照组降低,反映细胞增殖活力的增殖指数PrI值(S+G2M)%增高。结论:提示BMP具有促进人PDLC增殖的作用,可能主要是通过促使处于G1期的细胞进入S期来实现的。
关键词　流式细胞术　细胞周期　牙周膜细胞　骨形成蛋白

　　在对离体培养细胞等的细胞动力学研究中,应用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)较核素掺入法具有快速、简便、准确、


重复性好等优点,尤其是避免了核污染。本实验应用FCM常规的DNA单参数法观察了在正常和经骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)作用后,离体培养的人牙周膜细胞(periodontal ligament cell,PDLC)的DNA合成情况和细胞周期变化,探讨影响其增殖的原因和意义。

1　材料和方法

1.1　主要材料

　　取临床因正畸而拔除的青少年健康的前磨牙,无菌条件下刮取牙根中1/3牙周膜,用组织块法原代培养建立人PDLC有限细胞系。从小牛长骨中分离、提取出活性良好的bBMP。DNA荧光染料(碘化丙啶,PI)和流式细胞仪及专用多参数细胞周期分析软件由美国Coulter公司提供。

1.2　分组

　　空白对照组:无外源性因子作用的PDLC。实验组:经BMP(12.5 μg/ml)处理的PDLC。每组各2份标本,细胞量均保证在1×106/ml以上。

1.3　方法

　　取离体培养的人第7代PDLC,等量传代2份,在5%CO2、95%空气、37℃环境下,以含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的Dulbecco最低必须培养液(Dulbecco minimum essential medium,DMEM)培养24 h,按分组加入或不加入BMP,以含1%FBS的DMEM培养72 h;用胰酶消化下细胞,分别收集于各自的离心管内。短时低速离心(800～1000 r/min,5 min);弃上清,冷磷酸盐缓冲生理盐水(PBS,pH7.4)洗5 min,800 r/min离心,以去除细胞碎片,制备单细胞悬液。70%冷乙醇固定,4℃过夜。用冷PBS(pH7.4)洗5 min,800 r/min离心,反复2次。调整细胞数在1×106个/ml。各管加入PI染液,4℃染色30 min。上机FCM在氩激光光源,激发波长为488 nm。接收波长为610～630 nm,变异系数小于2%的条件下测试分析,联机专用软件分析处理。测定并计算出一个群体中各时相细胞的比例。

2　结　果

　　经流式细胞技术测试的实验组和对照组细胞周期时相结果见表1。由表1可见,经bBMP作用后,实验组的DNA合成前期细胞所占百分比(G1%)有所降低,而DNA合成期细胞所占百分比(S%)有所增高;反映增殖活力的增殖指数PrI值［包括DNA合成期(S),DNA合成后期(G2)和有丝分裂期(M)的细胞所占百分比,即(S+G0M%)］也相应的有明显增高。经卡方检验,实验组与对照组间有显著性差异(P<0.01)。

表1　实验组和对照组细胞周期时相测试结果(%)
组别 G1 S G2M PrI(S+G2M)
对照组 78.3 　7.0 14.7 21.7
实验组 64.7 10.9 24.4 35.3


3　讨　论
　　通过对各种不同细胞周期规律的研究,深入了解其各自的生长特性、受外界因素作用的特点和影响程度,可为临床治疗提供理论基础并对判断预后具重要意义。从细胞周期的代谢过程看,细胞周期各时相的DNA含量不同,G1期是细胞为过渡至S期作准备,发生的是与DNA合成有关的生化变化,如DNA聚合酶和RNA的合成等;各种细胞其周期的长短关键决定于G1期,增殖旺盛的细胞G1期持续时间短,终末分化和衰退的细胞则G1期时间长;相对的S期、G2期和M期是相对恒定的,而且增殖旺盛的细胞处于S期的比例较高。(S+G2M)%(增殖指数,PrI)就代表了该群体中增殖期细胞的数量,从一个侧面可反应出细胞增殖的状态［1～5］。利用FCM可测定并计算出一个群体中各时相细胞的比例。

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　　本实验应用的DNA复合荧光染料内含RNA酶,因此仅特异性地反映出DNA含量的变化。结果显示,PDLC的DNA合成受到了bBMP的影响和调节,bBMP能促进人PDLC增殖的作用,表现在实验组的DNA合成前期(G1期)细胞百分比降低,而DNA合成期(S期)细胞百分比和具有增殖分裂能力细胞的百分比(PrI)均有明显的增高,其可能的作用机制在于促使静止态的G1期细胞活跃而向S期转变,使DNA合成量增多,这与Canalis和Blom等的核素掺入实验报道相吻合。Canalis等［6］发现部分纯化的bBMP可增加胎鼠颅盖骨成骨样细胞和正常大鼠肾成纤维细胞的DNA合成和细胞增殖,Blom等［7］的研究还表明PDLC的DNA合成和增殖反应与所用生长因子的剂量成正相关。另外,Matsuda等［8］的研究显示当不同生长因子联合应用时较单独使用能进一步刺激增强PDLC的有丝分裂反应和新生骨的形成。但是,生长因子的各亚类对PDLC细胞周期的影响可能有所差异［9,10］。因此,如何有效的解决生长因子的应用方式以及复合配比、剂量等问题,还有待进一步深入研究。

本课题为国家自然科学基金资助项目(编号 39700035)

作者单位:第四军医大学口腔医学院　710032

参考文献

1　左连富主编.流式细胞术样品制备技术.北京:华夏出版社,1991:46～58
2　蔡文琴,王伯云主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都:四川科学技术出版社,1994:194～203
3　Canalis E. Effect of growth factors on bone cellreplication and differentiation. Clin Orthop, 1985, 193(3):246～257
4　陈兆聪主编.医学分子生物学.武汉:武汉大学出版社,1987:350～364
5　Disalvo CV, Zhang D, Jacobberger JW. Regulation of NIH-3T3 cell G1 phase transit by serum during exponential growth. Cells Prolif, 1995, 28(6):511～524
6　Canalis E, Centrella M, Urist MR. Effect of partially purified bone morphogenetic protein on DNA synthesis and cell replication in calvarial and fibroblast cultures. Clin Orthop, 1985, 198(9):289～296
7　Blom S, Holmstrup P, Dabelsteen E. A comparison of the effect of epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, and fibroblast growth factor on rat periodontal ligament fibroblast-like cells' DNA synthesis and morphology. J Periodontol, 1994, 65(5):373～378
8　Matsuda N, Lin WL, Kumar NM, et al. Mitogenic, chemotactic, and synthetic responses of rat periodontal ligament fibroblastic cells to polypeptide growth factors in vitro. J Periodontol, 1992, 63(6):515～525
9　Boyan LA, Bhargava G, Nishimura F, et al. Mitogenic and chemotactic responses of human periodontal ligament cells to the different isoforms of platelet-derived growth factor. J Dent Res, 1994, 73(10):1593～1600
10　Ripamonti U, Reddi AH. Periodontal regeneration: potential role of bone morphogenetic proteins. J Periodont Res, 1994, 29(4):225～235